在菌种分离、提纯及转扩过程中常因细菌污染而失败报废，在菌袋培养过程中培养料遭细菌污染和大量繁殖后，可导致培养料变质、菌丝生长受抑制或不能生长，并散发出臭味。引起污染的细菌主要有芽孢杆菌属(Bacillus)和荧光假单孢杆菌属(Pseudomonas)中的多种细菌。这些细菌的来源包括如下几个途径：①空气中飘浮有细菌的芽胞，分离、转扩及接种过程不是在无菌环境下进行操作而发生污染；②培养基或培养料本身带有细菌，消毒灭菌操作过程未将所有细菌杀死；③操作人员本身带有的细菌在操作过程引起污染；④培养袋受机械损伤或鼠害等原因造成破损后受细菌污染。菌种受细菌污染后如不能及时将细菌清除，受污染的菌种则不能使用和保存。栽培袋受细菌严重污染后，金针菇的菌丝生长受阻或菌袋不能出菇。污染细菌在实验室的平板培养皿或斜面试管的培养基表面形成圆形或近圆形，表面光滑或有皱纹，稍隆起，黏稠状的白色、乳白色或黄白色菌落，肉眼容易识别。但在菌种瓶或栽培袋的培养料中，则主要依靠观察金针菇菌丝生长状态及用嗅觉发现有无异味而判断。各种引起污染的细菌均适宜在较高温度和湿度条件下生长，培养料呈弱碱性时也有利细菌生长。含有一定浓度链霉素或土霉素的培养料可有效抑制细菌的生长。