为获得单一的、纯度高的灵芝菌种，就需要通过生物学手段，将灵芝从混杂的微生物群中分离出来。

灵芝菌种基内菌丝分离法

从灵芝生长的基质中分离获得纯菌丝的方法。如芝木、树根、土壤等作为分离材料进行分离。基内菌丝分离法在灵芝中很少应用，因为灵芝子实体生长时间较长，且一年春夏秋均会发生，取材比其他食用菌简单，且子实体存放时间较长。只有在进行灵芝资源调查，或选用野生种进行驯化时，当灵芝子实体已释放完孢子和老熟无法进行孢子分离和组织分离的情况下才采用。

芝木基内菌丝分离方法是，选用长有灵芝子实体、无裂褶菌和其他多孔菌等生长的枯木或树根，常水冲洗去泥沙、杂质。摘去灵芝子实体，并从长子实体两边锯断，若芝木（根）较粗用刀纵劈成数块。在无菌条件下，用75%酒精擦拭消毒，将带柄基部分置酒精灯火焰上灼烧，用手术刀削去表皮，每削一次均需灼烧1次，以防交叉感染。然后将长有白色菌丝的切削面切刮下微小的木片或颗粒，用接种铲移接至PDA斜面中央，28℃下遮光培养，见白色菌丝生长并长满管即为母体。